5-Ethynyl dUTP的强大功能，源于其背后的"点击化学"原理。这是一种高效、特异且生物相容性好的合成反应，被誉为"分子世界的乐高"。

其工作流程分为两步，精妙而可靠：

第一步：掺入DNA

在细胞培养体系或体外酶促反应（如PCR、测序）中，5-Ethynyl dUTP作为原料被DNA聚合酶使用，替代部分天然的dTTP，直接整合到新生DNA分子内部。

第二步：点击连接

整合了乙炔基的DNA，可以与带有叠氮基团（-N3）的报告分子（如荧光染料Alexa Fluor系列、生物素Biotin等）发生铜催化的环加成反应。

这个反应快速、高效、背景极低，能在温和条件下形成稳定的共价连接，从而实现对标记DNA的荧光成像、流式检测或亲和富集。